技术|食品中细菌总数平板检测方法

什么是菌落总数？

菌落总数是指在被检样品的单位质量(g)、容积(ml)或表面积(cm2)内，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。

从食品卫生观点来看，食品中菌落总数越多，说明食品质量越差，病原菌污染的可能性愈大。每种细菌都有它一定的生理特性，培养时只有分别满足不同的培养条件（如培养温度、培养时间、PH、需氧性质等）,才能将各种细菌培养出来。但在实际工作中，细菌菌落总数的测定一般都只用平板活菌计数法，因而并不能测出每克或每毫升中的实际总活菌数，因此所得结果，只反映一群在普通营养琼脂中发育的、嗜温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。菌落总数并不能区分细菌的种类，有时被称为杂菌数或需氧菌数等。

平板活菌计数法嗜根据微生物在固体培养基上所能形成的菌落的生理及培养特征进行的。        一个菌落即代表一个单细胞，但食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字应以单位质量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位数报告之。

细菌总数检测的意义

1、代表食品清洁状态的标志 

（1）食品中的细菌来自其生产、运输、储存、销售各环节中的外界污染；（2）在食品卫生标准中制定各种食品细菌总数的容许限量，可保证食品生产的清洁状态。

2、预测食品耐储藏的期限 

例：单位体积的鱼体菌落数目越少，在同样的储藏温度下，其保质期就越长。 

一、菌落总数检测常用器材

营养琼脂、8.5%无菌生理盐水、75%乙醇和冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、托盘天平、可调式电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿（皿底直径为9cm）、试管、试管架、酒精灯、均质器或乳钵、剪刀、灭菌镊子、75%酒精棉球、玻璃蜡笔、登记薄、不锈钢勺等器具用品 。

二、检验程序

1.做成几个适当倍数的稀释度

2.选择2~3个适宜稀释度，各取1ml加入灭菌平皿内

3.每皿内加入适量营养琼脂

4.培养（36+/-1）。C,(48+2)h

5.菌落计数

6.报告

三、操作方法

1、检样稀释及培养

（1）以无菌操作检样25ml(g)，放于225ml灭菌生理盐水或其他溶液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨制成1:10的均匀稀释液。

（2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管，混合均匀，制成1：100的稀释液。

（3）另取1ml灭菌吸管，按以上步骤操作顺序，做10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次。

（4）根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个是以稀释度，分别在做10倍递增稀释液的同时，即以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度在做两个平皿。

（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至45。C左右的营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。

（6）待琼脂凝固后，翻版平板，置（36+/-1。C）恒温箱内培养（48+/-2）h,取出，计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数即得1ml（g)样品所含菌落总数。

2、菌落计数方法

        做平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要使用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如不能，应将平板放置于0~4。C，但不要超过24h。

3、菌落计数报告

 （1）平板菌落数的选择       选取菌落数在30~300之间的平皿作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用2个平皿平均数。

（2）稀释度的选择及菌落报告方式

(3)菌落数的报告  

  为了正确地反映食品中各种需氧菌和兼性厌氧菌存在的情况，检验时须遵循以下要求和规定。

1、检验中所需玻璃仪器必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底清洗干净，不得有残留物

2、检验的稀释液可用灭菌盐水或蒸馏水。

3、注意每递增稀释一次，必须另换1支1ml灭菌吸管，这样所得检样的稀释倍数才准确。

4、为防止细菌增值产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20min内倾入琼脂，并立即使之与琼脂混合均匀。

5、为了控制和了解污染，在取样进行检验的同时，于操作台上打开一块琼脂平板，其暴露的时间应与该检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的时间相当，然后与加有检样的平皿一起培养，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。

6、培养温度为37。C，培养时间为（48+/-2）h。

7、加入平皿内的检样稀释液，有时带有检样颗粒，在这种情况下，为了避免与细菌菌落发生混淆，可做一检样稀释液与琼脂混合的平皿，不经培养，与4。C环境中放置，以便在计数检样菌落时用作对照。

8、检样如为微生物类制剂（如酸乳、乳酒），则平板计数中应相应地将有关微生物排除，不可并入检样的菌落总数中做报告。

9、平板活菌计数法只能检出生长的活菌，不能检出样品中全部的细菌数。

10、矿泉水和自来水等的检测，一般不稀释，直接取样进行琼脂平板培养。

四、细菌菌落总数测定的其他方法

1、平板表面涂布法

将营养琼脂制成平板，经50。C，1~2h或35。C，18~20h干燥后，于其上滴加检样稀释液0.2ml，用L行棒涂布整个平板表面，放置约10min，将平板翻转，移至（36+/-1）。C温箱内培养（24+/-2）h取出按前述方法进行菌落计数，然后乘以5换算为1ml检样的菌落数，再乘以样品的稀释倍数，即得每克或每毫升检样所含菌落数。

2、平板表面点滴法

 与涂布法相似。所不同者，是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴将检样稀释液滴加与琼脂平板固定的区域（预先标4个区域），每区域滴一滴，每个稀释度滴2个区域，作为平行试验。

五、非常见细菌菌落总数的测定方法

自然界存在的微生物绝大多数是嗜温性好氧菌，生产中的有益微生物、引起人类疾病的微生物和引起食品腐化变质的微生物也基本上是这一类型的。在这暂把非嗜温好氧性细菌称为非常见菌

六、非常见细菌菌落的测定方法包括

1、嗜冷菌的测定

2、嗜热菌（芽孢）计数

（1)平酸菌计数

（2）不产生硫化氢的嗜热性厌氧菌检验

（3）产生硫化氢的嗜热性厌氧菌计数

3、厌氧菌计数

4、革兰氏阴性菌计数

5、乳酸菌、乳酸链球菌、双歧杆菌计数

乳酸菌和乳酸链球菌是酸奶生产中常见菌种，检验乳酸菌饮料中这两种菌的含量，可以对产品的质量做出正确的评价。双歧杆菌计数是人体肠道中正常的菌群，对保持肠道微生态环境有益。